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均質ポリマー連鎖反応（POLYMER CHAIN REACTION ）｛ピーシーアール（PCR） ｝フラグメントの同定 本発明が均質ピーシーアールフラグメントの同定に適用された。本方法は最初 にデーエヌエイ溶解カーブ（DNA melting curve）の情報豊富な部分を同定し、 次いで該入力スペクトラムの情報豊富な部分集合を使用して最適モデルを発展さ せる。 背景 デーエヌエイフラグメント同定は伝統的にゲル電気泳動（gel electrophoresi s）により行われて来た。挿入染料（intercalated dyes）を使用する代替え方法 はあり得る時間と感度での利点を提案している。この方法は、加熱時２重螺旋デ ーエヌエイが変性する（捲きほごれる）と該染料蛍光量（dye fluorescence）が 減少することの観察に基づいている。温度に対する蛍光量をプロットする、最終 のいわゆる”溶解曲線（melt curve）”のデータ解析は該デーエヌエイフラグメ ントのユニークな同定のベースを提供する。しかしながら、該方法は、特定的デ ーエヌエイフラグメントの精確な同定を、他の非特定的フラグメントの存在及び 背景基盤（background matrix）からの蛍光ノイズの存在の両場合で、要求して いる。 スパイク（spiked）される食料サンプルの準備 この研究はピーシーアールを禁ずる知られる食料を評価した。該評価は、該禁 止食料の禁止効果を克服するために、該反応へのウシ血清アルブミン（bovine s erum alubumin）｛ビーエスエイ（BSA）｝の添加能力をテストした。加えて、溶 解曲線解析を使用したピーシーアール製品の均質性検出が臭化エチジウム染色（ ethidium bromide staining）を有する標準的ゲル電気泳動と比較された。 食料は地域の食料雑貨店で購入され、４℃で貯蔵された。３０の異なる食料が ビーエイエム（BAM）手順で事前強化（per-enriched）された。処方された強化 法（enrichment）に従い、サンプルはサルモネラニューポート（Salmonella new port）でスパイクされるか又はスパイクされずに残されたが、表ＩＩＩ参照。該 強化は次いでビーエイチアイ（BHI）｛デーアイエフシーオー（Difco）｝内で１ ：１０に薄められ、次いで３７℃で３時間培養された。 ポリビニルポリピロリドン（Polyvinylpolypyrrolidone）｛ピーブイピーピー（ PVPP）｝処理 グローバックサンプル（growback）の５００マイクロリットル（500 ul）のア リコート（aliquot）がピーブイピーピー｛クアリコン社（Qualicon, Inc.）｝ の５０ｍｇのタブレットを含むチューブに追加された。該チューブはボルテック ス（vortexed）されそして該ピーブイピーピーは１５分間澄むようにされた。最 終浮遊物は次いで溶解過程で使用される。 サルモネラサンプルの準備 ２ｍｌのスクリューカップチューブ（screw cup tube）で、強化すなわちピー ブイピーピー処理サンプルの５マイクロリットルがデーエヌエイ挿入染料エスワ イビーアールグリーン（DNA intercalating dye SYBR R Green）｛モレキュラー プローブ（Molecular Probes）｝の１：１０、０００希釈を含む溶解試薬｛５ｍ ｌビーエイエックス溶解バッフアー（5ml BAX R lysis buffer）と６２．５ｕｌ （マイクロリットル）ビーエイエックスプロテアーゼ（62.5 ul BAX R Protease ）｝の２００ｕｌ（マイクロリットル）に加えられた。該チューブは３７℃で２ ０分間次いで９５℃で１０分間培養された。９５℃の培養の後、４ｍｇ／ｍｌの ビーエスエイ（BSA）溶液の５０ｕｌ（マイクロリットル）が該溶菌液（lysate ）に追加された。これはピーブイピーピー処理済みと未処理のサンプルに行われ た。対照として、幾つかのサンプル未処理で残された。この未精製バクテリヤ溶 菌液の５０マイクロリットルが、パーキンエルマー７７００シークエンスデテク ター計器（Perkin Elmer 7700 Sequence Detector instrument）で使用されるピ ーシーアールチューブ内に含まれた１つのビーエイエックスサルモネラサンプル タブレット（BAX R Salmonella sample tablet）を水和するため使用された。該 チューブはキャップを付けられ、パーキンエルマー９６００サーマルサイクラー （Perkin Elmer 9600 thermal cycler）内で次のプロトコルに依り熱サイクルに かけられた。 ９４℃ ２．０分 １サイクル ９４℃ １５秒 ３５サイクル ７２℃ ３．０分 ７２℃ ７分 １サイクル ４℃ ”長期間（forever）” 増幅後分析（Post Amplification Analysis） 増幅後、下記条件で運転することによりパーキンエルマー７７００デーエヌエ イシークエンスデテクター（Perkin Elmer 7700 DNA Sequence Detector）上で 該溶解曲線が作られた。, スロット 爆発力 2023. プレートの種類： シングルリポーター（Single Reporter） 器械： ７７００シークエンスデテクションシステム（7700 S equence Detection System） 運転： 実時間 染料層： エフエイエム（FAM） サンプルの種類： 未知である サンプル容積： ５０ｕｌ（マイクロリットル） 運転条件： ７０℃ ２分１サイクル データ収集せず ６８℃ １０秒９８サイクル データ収集する 自動インクレメント ＋０．３℃／サイクル ２５℃ ”長期間” 該多成分データは該器械から移出され該分析に使用された。特定のデーエヌエ イフラグメントの製作は該アンプリフアイ（amplified）されたサンプルにビー エイエックスローデイングダイ（BAX R Loading Dye）の１５マイクロリットルを 添加することにより検証された。次いで１５マイクロリットルのアリコートが臭 化エチジウムを含む２％アガロースゲル（agarose gel）のウエル（well）内に 装填された。該ゲルは３０分間１８０ボルトで運転された。特定の生成物は次い でユーブイトランスイルミネーション（UV transillumination）を使用して可視 化された。 データ分析 生の蛍光量（raw fluorescence）データが処理用にマイクロソフトエクセル（ Microsoft Excel）に移入された。この段階からデータを可視化し該データから 予測をするため分岐的取り組みが使用された。 データ事前処理（Data Preprocessing） 蛍光ノイズを減らすために該データを事前処理することは成功するモデリング の尤度（likelihood）を増すことが実験的に決定された。該データ事前処理は次 の過程から成り、すなわち、 ａ．蛍光データ（fluorescence data）の正規化、 ｂ．０．１℃の解像度でキュービックスプライン関数（cubic spline functio n）を用いた該正規化蛍光の内挿補間、 ｃ．内挿補間された蛍光スペクトラムの対数を取る、 ｄ．２５点サビツスキーゴレイ平滑化関数（25 point Savitsky Golay smooth ing function）を用いた該蛍光の対数の平滑化、 である。 最終温度スペクトラムはここで説明されるモデリング方法への入力の集合とし て使用される。該温度スペクトラムを使用した２つの異なるモデリング例を説明 する。 過程ａ．データの正規化と可視化 該蛍光データは、最初にスペクトラム内の最低測定蛍光レベルを決定し、この 値を、直流オフセットを除くために、該スペクトラム内の各点から引くことによ り正規化される。上記の過程ａ．の正規化されたデータは次いでサビツスキーゴ レイの平滑化アルゴリズム(Savitzky-Golay smoothing algorithm)で平滑化され る。温度に対する平滑化蛍光の負の導関数｛−ｄｌｏｇ（Ｆ）／ｄＴ｝が取られ 、−ｄｌｏｇ（Ｆ）／ｄＴ（ｙ軸）対温度（ｘ軸）としてプロットされる。 過程ｂ．該データからの予測 該正規化されたデータからスタートして、キュービックスプライン内挿関数（ cubic spline interpolating function）を使用して０．１Ｃ分解能で該データ は内挿補間される。次いで該内挿されたデータの対数が取られ、次いで２．５度 （すなわち０．１℃で２５の点）上でサビツスキーゴレイの平滑化アルゴリズム を用いて平滑化される。温度に対する該ログの蛍光の負の導関数が取られ｛−ｄ （ｌｏｇＦ）／ｄＴ｝、サルモネラ用データ範囲：８２．０℃−９３．０℃（１ ２データ点）を用いて１．０Ｃ間隔でパース（parsed）された。 方法比較用に、ここに説明された方法は２つの他の良く知られたモデリング方 法：ニューラルネットワーク及びロジスティック回帰（logistic regression） 、と比較され、結果は下表で報告される。 見出された最も有効なＤＮＡフラグメント同定法は２つのモデリングスキーム をシーケンシャルな仕方で背中合わせで使うことを含んでいる。同定の第１レベ ルはスメア（smear）を非スメア（non-smear）から分離することである。これに 、非スメアサンプル用に関心のある特定のデーエヌエイフラグメントを同定する ことが続く。実際は、この階層的方法は、起こり得る出力カテゴリーを表す正、 負そしてスメアを有する１つの３状態モデルを使用するより精確であった。 １．特定ピーシーアールフラグメントに対する非特定ピーシーアールフラグメン トのモデリング 該ピーシーアールアンプリフイケーション過程（PCR amplification process ）は、関心のあるデーエヌエイの特定の種類に対応するフラグメントのみならず 非特定ピーシーアールフラグメントも作る。第１例は本方法の該非特定と特定の ピーシーアールフラグメント間を区別する能力を展示する。１４９のロックされ たプロセス（すなわち、対照）特定的トレーニングスペクトルと、問題食料（ピ ーシーアール用で問題があると知られる実際の食料）の３０９のテストスペクト ルと、一緒に３０の非特定的又は”スメア”の蛍光スペクトルのグループが創ら れた。０．１℃の温度分解能を有して、１１１点を含む各サンプル用の温度スペ クトル（１１．１℃の範囲上の）が創られた。該ロックされたプロセスと問題食 料サンプルの両者が陽性と陰性の標本を含んだ。この例で、該陽性のサンプルは 特定のバクテリヤ（例えば、サルモネラ）でスパイクされ（すなわち汚染され） そして陰性のサンプルはスパイクされぬ（汚染されぬ）ようにされた。該スメア サンプルはロックされたプロセストレーニング集合（１２スメアサンプル）と問 題食料テスト集合（１８スメアサンプル）の両者にランダムに導入された。該陽 性及び陰性の両サンプル状態は合併され２進のゼロ”０”文字でラベル付けされ 、該スメアサンプル状態は２進の１”１”でラベル付けされた。 ａ．入力の最も情報豊富な集合を発展させること モデリング過程の第１歩は１１１次元の入力フイーチャー空間をより少ない、 より情報豊富な部分集合に減じることである。前に説明した発展型フレームワー クが該最も情報豊富なフイーチャーを発展させるために使用された。１００の遺 伝子の初期遺伝子プールがランダムに発生され、そこでは各遺伝子は２進の１１ １ビットの長さの記号列を有し、各ビットの状態は該対応入力フイーチャーが該 遺伝子内で賦活されたかどうかを表している。該発展過程はセル当たり１サンプ ルとなるべき平均セル占有数（mean cell occupation number）により抑えられ 、そして該発展は５世代より多く進んだ。各遺伝子の発展をドライブするために 、グローバルエントロピー、又は適応度関数としてローカルエントロピーの数加 重和（number-weighted-sum of local entropies）が使用された。該発展は固定 サイズ化された部分範囲（すなわち、適応型ビニングよりむしろ、固定されたビ ン）を使用して進みそして該データは、上記説明の様に、０及び１の出力状態の 数をバランスさせるようバランスさせられた。 発展型過程を通して該１００の最も情報豊富な遺伝子のグローバルリストが保 持された。全ての１１１の入力フイーチャーのビット頻度のヒストグラムが、発 展した該情報豊富な遺伝子プール内で最も屡々発生するビットを同定するために 、該発展の各世代の終わりで分析された。このヒストグラムはどの温度点が該出 力状態に最も密接に付随したかについての情報を提供した。 Verajohn withdraw time Wi-fi facility is available in the college campus particularly in the Administrative block, Library and Departments, ゼウス3ビットコインスロットを無料でプレイする. 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